Tháng 8 năm 1940, cậu bé Nguyễn Văn Thuận nhập học tại Tiểu chủng viện An Ninh, tại Cửa Tùng, Quảng Trị, sau đó, theo học triết và thần học tại Đại chủng viện Kim Long, Huế. Ngày 11 tháng 6 năm 1953, Phanxicô Xaviê Nguyễn Văn Thuận được thụ phong linh mục tại Nhà thờ chính tòa Phủ Cam, do Giám mục Jean-Baptiste Urrutia Thi (M.E.P) – Giám mục Đại diện Tông Tòa Địa phận Huế làm chủ phong.[2]

Sau khi được chịu chức, tân linh mục Nguyễn Văn Thuận được bổ nhiệm đảm trách vị trí linh mục phụ tá giáo xứ Tam Tòa, Đồng Hới, làm phụ tá cho linh mục Đa Minh Hoàng Văn Tâm. Sau đó, linh mục Thuận được chuyển đến Giáo xứ Phanxicô Xaviê – Huế, làm phụ tá cho Linh mục Richard Barbon, tên Việt là Triết.[2] Sau một vài tháng tại giáo xứ Phanxicô Xaviê, Giám mục Urrutia lại bổ nhiệm Linh mục Thuận làm tuyên úy của Viện Pellerin, Bệnh viện Trung ương, và các nhà tù tỉnh.[5] Linh mục Thuận trước đó đã tình nguyện làm tuyên úy cho các địa điểm nhà tù, nhà thương, trại cùi.[8]

Từ năm 1956 đến năm 1959, linh mục Nguyễn Văn Thuận được cho đi du học tại Phân khoa Giáo luật thuộc Ðại học Giáo hoàng Urbaniana, Roma. Ông hoàn thành việc học và tốt nghiệp với văn bằng tiến sĩ Giáo luật. Luận án Tiến sĩ của ông mang chủ đề: Studium comparativum de organisatione capellanorum militum in mondo ("Tổ chức Tuyên úy Quân đội trên thế giới").[2] Trong thời gian du học, ông có dịp tiếp xúc, sinh hoạt với các phong trào Ðạo Binh Ðức Mẹ, Hướng Ðạo, Cursillos, Focolare. Các phong trào này ảnh hưởng đến đường lối hoạt động của ông sau này.[9]

Trở về nước, năm 1960, linh mục Phanxicô Xaviê Thuận được cử làm giáo sư Tiểu Chủng viện Huế.[2] Một thời gian ngắn sau đó, ông khởi công xây cất cơ sở mới và thành lập Tiểu chủng viện Hoan Thiện ở ngay thành phố Huế, cạnh trường Thiên Hữu.[9] Từ năm 1962, linh mục Thuận đảm trách vai trò làm Giám đốc Tiểu chủng viện Hoan Thiện. Hai năm đó, Tổng giám mục Huế Phêrô Máctinô Ngô Đình Thục chọn ông làm linh mục Tổng Đại diện Tổng giáo phận Huế.[2]